Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLC γ2: sc-400451-ACT

PLCG2 code pour la phospholipase C gamma 2 (PLCγ2), une enzyme de transduction du signal qui hydrolyse le PIP2 pour produire de l’IP3 et du DAG, déclenchant la mobilisation intracellulaire de Ca2+ et l’activation de la protéine kinase C. PLCγ2 agit en aval de la signalisation des immunorécepteurs et des récepteurs Fc, et intègre des signaux issus des voies du récepteur des cellules B, des récepteurs de l’immunité innée et des réseaux de tyrosine kinases afin de réguler la prolifération, la différenciation, la production de cytokines et les réponses des phagocytes. En biologie humaine, une activité altérée de PLCG2 a été associée à une dysrégulation immunitaire et à des phénotypes inflammatoires, et ce gène est largement étudié dans les cellules hématopoïétiques, où des programmes de signalisation dépendants du calcium façonnent le destin des cellules immunitaires. Ces propriétés font de PLCG2 un nœud utile pour disséquer les circuits de signalisation proximaux aux récepteurs, les réponses transcriptionnelles et la dynamique des seconds messagers dépendante du stimulus.

PLC γ2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PLCG2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLC γ2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PLCG2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PLCG2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLC γ2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PLCG2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLC γ2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLC γ2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PLCG2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.