Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLAP: sc-400629-ACT

ALPP code la phosphatase alcaline placentaire (PLAP), une ectoenzyme ancrée à la glycosylphosphatidylinositol (GPI) qui déphosphoryle des substrats extracellulaires et contribue à l’homéostasie du phosphate à la surface cellulaire. L’activité de la PLAP est associée à l’organisation des microdomaines membranaires, à la modulation de la signalisation purinergique via la déphosphorylation des nucléotides, ainsi qu’au contrôle plus global du métabolisme extracellulaire des phosphomonoesters. Dans les tissus humains, ALPP est particulièrement exprimé dans le placenta et est fréquemment utilisé comme marqueur associé à la différenciation en biologie du trophoblaste et dans des contextes liés aux cellules germinales. Une expression dérégulée d’ALPP/PLAP a été rapportée dans de multiples situations pertinentes pour les maladies, ce qui étaye son utilité pour étudier les programmes de lignée, la fonction des enzymes de surface cellulaire et les états d’expression associés aux tumeurs dans des modèles expérimentaux.

PLAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALPP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALPP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALPP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALPP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLAP dans les cellules tumorales présentant une expression de ALPP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.