Particules Lentivirales d'Activation (m2) PKD2: sc-430381-LAC-2

Chez la souris, Prkd2 code la protéine kinase D2 (PKD2), une kinase sérine/thréonine de la famille PKD qui transmet des signaux en aval du diacylglycérol et des isoformes nouvelles de la PKC afin de coordonner des programmes de phosphorylation contrôlant l’expression génique, le trafic vésiculaire, la dynamique du cytosquelette et la survie cellulaire. L’activité de PKD2 est fréquemment associée à des signalisations au niveau du Golgi et des membranes, intégrant des entrées issues des voies des GPCR et des récepteurs à activité tyrosine kinase pour réguler des réponses liées aux MAPK et à NF-κB ainsi que le remodelage cellulaire dépendant des stimuli. La dérégulation de la signalisation PRKD2/PKD2 a été associée à une prolifération aberrante, à une signalisation inflammatoire et à des caractéristiques métastatiques en biologie du cancer, ainsi qu’à des rôles plus larges dans les processus liés au stress et à l’immunité. L’édition génétique de Prkd2 dans des modèles murins permet des études mécanistiques de la fonction du domaine kinase, des interactions entre voies de signalisation et des phénotypes dépendants de la phosphorylation, au moyen de la protéomique, de l’imagerie de cellules vivantes et de paradigmes in vivo pertinents pour les maladies.

Les particules d'activation lentivirales PKD2 (m2) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de Prkd2 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales PKD2 (m2) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription Prkd2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de PKD2. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif Prkd2 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.