PISD CRISPR Activation Plasmid (m): sc-435844-ACT

Die murine PISD (Phosphatidylserin-Decarboxylase) ist ein Enzym der inneren Mitochondrienmembran, das die Umwandlung von Phosphatidylserin zu Phosphatidylethanolamin katalysiert – ein zentraler Schritt im Phospholipid-Remodeling, das für Membranbiogenese und Organelldynamik erforderlich ist. Indem PISD die Verfügbarkeit von Phosphatidylethanolamin beeinflusst, unterstützt es die mitochondriale Morphologie, die Leistungsfähigkeit der oxidativen Phosphorylierung sowie Prozesse, die mit lipidabhängiger Signalgebung und Autophagie gekoppelt sind. Störungen der PISD-abhängigen Lipidhomöostase sind für Untersuchungen mitochondrialer Stressantworten und metabolischer Anpassung relevant und wurden in genetischen Krankheitskontexten mit neuroentwicklungsbedingten und neuromuskulären Phänotypen in Verbindung gebracht. Entsprechend wird Pisd häufig in Signalwegen untersucht, die mitochondriale Funktion, Membrantransport und eine durch den Lipidstoffwechsel getriebene zelluläre Fitness regulieren.

PISD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pisd-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PISD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pisd-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pisd-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PISD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pisd-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PISD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PISD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pisd-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.