Plasmide CRISPR d'Activation (h) PIP5KIII: sc-402813-ACT

PIKFYVE code la phosphatidylinositol-3-phosphate 5-kinase de type III (PIP5KIII), une kinase lipidique qui produit le PI(3,5)P2 et contribue à l’identité membranaire endolysosomale, au trafic vésiculaire et à l’homéostasie des lysosomes. PIP5KIII agit au sein du complexe PIKFYVE–VAC14–FIG4 pour réguler la maturation des endosomes, le flux autophagique et les voies de signalisation sensibles aux nutriments, reliant ainsi le métabolisme des phosphoinositides à l’adaptation cellulaire au stress. La perturbation de cette voie modifie la dynamique des vacuoles/lysosomes et est associée à des phénotypes neurodégénératifs et neuromusculaires, faisant de PIKFYVE un nœud clé pour l’étude des défauts de trafic membranaire. La régulation de PIKFYVE chez l’humain est également pertinente pour les recherches sur l’entrée des agents pathogènes, le renouvellement des récepteurs et la signalisation métabolique dépendant du tri endosomal.

PIP5KIII Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PIKFYVE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PIP5KIII Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PIKFYVE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PIKFYVE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PIP5KIII. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PIKFYVE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PIP5KIII au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PIP5KIII dans les cellules tumorales présentant une expression de PIKFYVE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.