Plásmido CRISPR de Activación (h) PINK1: sc-400739-ACT

PINK1 (quinasa 1 putativa inducida por PTEN) codifica una quinasa de serina/treonina dirigida a las mitocondrias que actúa como sensor clave del daño mitocondrial e iniciadora de la mitofagia. Ante la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, PINK1 se acumula en la membrana externa de la mitocondria y promueve el reclutamiento y la activación de PRKN/Parkin, coordinando la eliminación dependiente de ubiquitina de orgánulos dañados y la remodelación de la dinámica mitocondrial. Esta vía se integra con respuestas celulares al estrés, incluidas la señalización por estrés oxidativo, la proteostasis y la activación de la inmunidad innata vinculada a la disfunción mitocondrial. La alteración de la actividad de PINK1 se ha implicado en la neurodegeneración y en otros trastornos caracterizados por un control de calidad mitocondrial defectuoso, por lo que es una diana ampliamente utilizada en estudios de homeostasis mitocondrial.

PINK1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PINK1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PINK1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PINK1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PINK1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PINK1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PINK1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PINK1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PINK1 en células tumorales con expresión de PINK1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.