Plasmide CRISPR d'Activation (h) PI 3-kinase p55γ: sc-402964-ACT

PIK3R3 code la sous-unité régulatrice p55γ de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) de classe IA, qui s’associe aux isoformes catalytiques p110 pour relayer les signaux provenant des récepteurs à activité tyrosine kinase activés et des protéines adaptatrices vers la production, en aval, de seconds messagers lipidiques. Par la génération de PIP3, la signalisation PI3K coordonne l’activité de l’axe AKT–mTOR, influençant la croissance cellulaire, la survie, le métabolisme et la dynamique du cytosquelette. La dérégulation des composants de la voie PI3K, y compris des sous-unités régulatrices qui ajustent l’activité de la kinase et le couplage aux récepteurs, est fréquemment étudiée dans des contextes tels que la signalisation oncogénique, les réponses à l’insuline/IGF et les programmes d’adaptation au stress. PIK3R3 est donc étudié pour sa contribution à l’amplitude de la voie et au contrôle par rétroaction, susceptibles de façonner des phénotypes liés à la transformation, à la prolifération et à la plasticité de la signalisation.

PI 3-kinase p55γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PIK3R3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PI 3-kinase p55γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PIK3R3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PIK3R3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PI 3-kinase p55γ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PIK3R3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PI 3-kinase p55γ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PI 3-kinase p55γ dans les cellules tumorales présentant une expression de PIK3R3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.