PI 3-kinase p110β Plásmido CRISPR/Cas9 KO (m): sc-428980

Descripción general

Pik3cb codifica la subunidad catalítica p110β de la fosfoinosítido 3-quinasa de clase IA, una quinasa lipídica clave que genera PIP3 para propagar la señalización PI3K–AKT–mTOR aguas abajo de receptores tirosina quinasa y de GPCR. En células de ratón, p110β contribuye a la regulación del crecimiento celular, el metabolismo, la supervivencia, la remodelación del citoesqueleto y el tráfico vesicular, con funciones dependientes del contexto distintas de las de otras isoformas de PI3K. La actividad alterada de la vía PI3K se ha implicado ampliamente en la señalización oncogénica, la regulación de la insulina y del metabolismo, la función de las células inmunitarias y la biología plaquetaria, lo que convierte a Pik3cb en un nodo útil para desentrañar el cableado de la vía y los mecanismos compensatorios. La perturbación funcional de p110β ayuda a aclarar las contribuciones específicas de cada isoforma a la proliferación, la migración y las respuestas al estrés en diversos modelos celulares.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO PI 3-kinase p110β (m) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen Pik3cb en líneas celulares mouse. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus Pik3cb, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR PI 3-kinase p110β (m) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido Pik3cb.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido PI 3-kinase p110β CRISPR/Cas9 KO (m):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto Pik3cb.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus Pik3cb y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones Pik3cb críticos para la función PI 3-kinase p110β
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.