PHT2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425761-ACT

Mouse Slc15a3 kodiert den protonengekoppelten Histidin- und Oligopeptidtransporter PHT2 (SLC15A3), einen endolysosomalen Membrantransporter, der den Peptid- und Histidinfluss in sauren intrazellulären Kompartimenten unterstützt. Durch die Regulation der Substratverfügbarkeit und des vom luminalen pH abhängigen Transports trägt PHT2 zu lysosomenassoziiertem Stoffwechsel und zur Peptidverarbeitung bei, was die Antigenprozessierung und Netzwerke der angeborenen Immun-Signalgebung beeinflussen kann. Die Expression von Slc15a3 ist in myeloiden Zelllinien angereichert und wird häufig mit inflammatorischer Stimulation in Verbindung gebracht, wodurch es in Signalwege eingeordnet wird, die sich mit Wirtsabwehr und stressresponsiven Transkriptionsprogrammen überschneiden. Eine Fehlregulation des lysosomalen Transports und der Immunaktivierung ist für Modelle chronischer Entzündung und immunvermittelter Gewebeschädigung relevant, was Slc15a3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien macht.

PHT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc15a3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PHT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc15a3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc15a3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PHT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc15a3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PHT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PHT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc15a3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.