PHOSPHO1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433594-ACT

Phospho1 kodiert PHOSPHO1, eine in mineralisierenden Geweben angereicherte Phosphatase, die Phosphoethanolamin und Phosphocholin hydrolysiert, um anorganisches Phosphat zu erzeugen, und damit die durch Matrixvesikel vermittelte Initiation der Hydroxylapatitablagerung unterstützt. In der Maus ist die PHOSPHO1-Aktivität in die Phosphathomöostase und Programme der Skelettentwicklung eingebunden und wirkt zusammen mit Mineralisationsregulatoren wie der alkalischen Phosphatase, um die Funktion von Osteoblasten und Chondrozyten zu prägen. Eine Störung oder Fehlregulation von PHOSPHO1 wird mit beeinträchtigter Knochenmineralisation und veränderter Reifung der extrazellulären Matrix in Verbindung gebracht, was das Gen für Untersuchungen zur Skelettfragilität und zu entwicklungsbedingten Knochenerkrankungen relevant macht. Als Knotenpunkt der Mineralisationsbiologie wird es häufig in Signalwegen untersucht, die die Osteogenese, den Übergang von Knorpel zu Knochen und die lokale Phosphathandhabung steuern.

PHOSPHO1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Phospho1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PHOSPHO1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Phospho1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Phospho1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PHOSPHO1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Phospho1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PHOSPHO1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PHOSPHO1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Phospho1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.