Plasmide CRISPR d'Activation (m) PEPCK-C/PCK1: sc-422131-ACT

Le gène murin *Pck1* code la phosphoénolpyruvate carboxykinase cytosolique (PEPCK-C), une enzyme limitante de la gluconéogenèse qui convertit l’oxaloacétate en phosphoénolpyruvate et relie les intermédiaires du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs) à la production de glucose. La PEPCK-C intègre les signaux hormonaux et nutritionnels afin de coordonner la production hépatique de glucose et, plus largement, les flux de carbone à travers la glycolyse/la gluconéogenèse ainsi que les voies anaplérotiques et cataplérotiques. Une régulation modifiée de *Pck1* est fréquemment utilisée comme marqueur moléculaire d’adaptation métabolique, notamment lors du jeûne, de la signalisation de l’insuline et du glucagon, et des variations du cycle des substrats entre mitochondrie et cytosol. Une expression dérégulée de *Pck1* est associée à des phénotypes métaboliques tels que la résistance à l’insuline, la stéatose hépatique et une homéostasie glucidique altérée dans des modèles murins.

PEPCK-C/PCK1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pck1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PEPCK-C/PCK1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pck1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pck1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PEPCK-C/PCK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pck1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PEPCK-C/PCK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PEPCK-C/PCK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Pck1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.