Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pellino 1: sc-402184-ACT

Le gène humain PELI1 code Pellino 1, une ligase E3 de l’ubiquitine de type RING, qui agit comme adaptateur et régulateur de l’ubiquitination dans la signalisation immunitaire innée et adaptative. Pellino 1 participe aux voies des récepteurs Toll-like et du récepteur de l’interleukine-1, et module l’activation en aval de NF-κB et des MAPK en orchestrant l’assemblage de complexes dépendants de l’ubiquitine et la durée du signal. Par ces fonctions, PELI1 influence la production de cytokines inflammatoires, l’état d’activation des lymphocytes et l’homéostasie immunitaire. Une activité dérégulée de Pellino 1 a été associée à une signalisation inflammatoire aberrante et à des mécanismes de maladies à médiation immunitaire, ce qui en fait une cible d’intérêt pour l’étude des points de contrôle de la transduction du signal et de la régulation des voies de l’ubiquitine.

Pellino 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PELI1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pellino 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PELI1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PELI1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pellino 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PELI1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pellino 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pellino 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PELI1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.