Plasmide CRISPR d'Activation (m) PCTAIRE-3: sc-422147-ACT

Cdk18 code la kinase sérine/thréonine PCTAIRE-3, membre de la famille des kinases apparentées aux kinases dépendantes des cyclines (CDK), impliquée dans la coordination des signaux associés au cycle cellulaire avec les processus du cytosquelette et du trafic membranaire. Dans les cellules murines, l’activité de PCTAIRE-3 a été associée à la régulation de la prolifération cellulaire, des programmes de différenciation et de nœuds de signalisation sensibles au stress, qui intègrent des cascades de kinases à des réponses transcriptionnelles. Comme pour d’autres CDK atypiques, une expression modifiée ou un contexte de signalisation différent peuvent influer sur des voies pertinentes pour l’homéostasie tissulaire, le développement neuronal ou germinal, ainsi que des phénotypes oncogéniques, via des effets sur le contrôle des points de contrôle et la survie cellulaire. Ces propriétés font de Cdk18 une cible utile pour disséquer l’architecture des réseaux de kinases et la régulation contextuelle de la croissance et de la différenciation.

PCTAIRE-3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cdk18 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PCTAIRE-3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cdk18 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cdk18, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PCTAIRE-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cdk18 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PCTAIRE-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PCTAIRE-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cdk18 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.