Pax-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401657-ACT

PAX3 codifica o fator de transcrição com domínio paired box Pax-3, um regulador-chave do padrão embrionário que coordena a especificação da crista neural, a miogênese e o comprometimento da linhagem de melanócitos. Pax-3 controla programas de expressão gênica que governam a manutenção, a migração e a diferenciação de progenitores, integrando-se a redes de sinalização do desenvolvimento, incluindo as vias WNT, BMP e FGF. Na biologia humana, alterações na regulação de PAX3 estão associadas a fenótipos de pigmentação e de desenvolvimento craniofacial e são frequentemente estudadas em contextos de plasticidade de linhagem. A atividade desregulada de PAX3 também é relevante para a circuitaria transcricional oncogênica, incluindo mecanismos mediados por fusões e estados aberrantes semelhantes a células-tronco em modelos de pesquisa de sarcoma e melanoma.

Pax-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAX3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Pax-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAX3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAX3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Pax-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAX3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Pax-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Pax-3 em células tumorais com expressão de PAX3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.