Plasmide CRISPR d'Activation (h) PASK: sc-416953-ACT

La sérine/thréonine-protéine kinase contenant un domaine Per-Arnt-Sim (PAS) (PASK) agit comme une kinase détectrice des nutriments et de l’état énergétique, reliant les signaux métaboliques à l’expression génique et aux décisions de destin cellulaire. Dans les cellules humaines, PASK intègre des signaux liés à la disponibilité en glucose et au fonctionnement mitochondrial et module des programmes transcriptionnels en aval impliqués dans le métabolisme des glucides et des lipides, notamment des voies associées à la différenciation endocrine pancréatique et à des processus sensibles à l’insuline. L’activité de PASK a été étudiée dans le contexte de réseaux de signalisation proches d’AMPK et de mTOR, où elle peut influencer l’équilibre entre anabolisme et catabolisme ainsi que les réponses adaptatives au stress. Une expression ou une signalisation dérégulée de PASK a été associée à des phénotypes métaboliques pertinents pour la recherche sur le diabète et l’obésité, et a également été explorée pour ses rôles plus larges dans la prolifération et l’adaptation cellulaire.

PASK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PASK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PASK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PASK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PASK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PASK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PASK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PASK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PASK dans les cellules tumorales présentant une expression de PASK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.