PA28γ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403397-ACT

PSME3 codifica a subunidade ativadora do proteassoma humano PA28γ, um regulador nuclear da função do proteassoma 20S que modula a degradação de proteínas independente de ATP e de ubiquitina. A PA28γ contribui para o controle da proteostase, impacta a progressão do ciclo celular e as respostas ao estresse, e influencia a degradação de proteínas regulatórias específicas que moldam programas transcricionais. Por meio de seu papel no processamento mediado pelo proteassoma, a PA28γ se conecta a vias que governam as respostas a danos no DNA, a regulação associada à cromatina e a sinalização inflamatória. Alterações na expressão ou atividade de PSME3 têm sido associadas na literatura a proliferação desregulada e fenótipos oncogênicos, sustentando seu uso como um nó mecanístico em biologia do câncer e em estudos da via do proteassoma.

PA28γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PSME3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PA28γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PSME3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PSME3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PA28γ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PSME3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PA28γ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PA28γ em células tumorais com expressão de PSME3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.