Plásmido CRISPR de Activación (h) p70 S6 kinase β: sc-400409-ACT

El gen humano RPS6KB2 codifica la quinasa S6 p70 β, una quinasa de serina/treonina de la familia AGC que actúa aguas abajo de la señalización PI3K–AKT–mTOR para acoplar las señales de nutrientes y de factores de crecimiento con la síntesis de proteínas y el crecimiento celular. Al fosforilar sustratos implicados en el inicio de la traducción y la biogénesis ribosomal, la quinasa S6 p70 β contribuye a regular el tamaño celular, la proliferación y la adaptación metabólica ante condiciones ambientales cambiantes. La desregulación de la señalización mTOR/S6K se estudia con frecuencia en el contexto de alteraciones del metabolismo anabólico y de respuestas al estrés en el cáncer y otros trastornos proliferativos, donde un control translacional aberrante y la señalización por retroalimentación pueden remodelar la salida de la vía. La actividad de RPS6KB2 también es relevante en investigaciones sobre la señalización de la insulina, la bioenergética celular y el “cross-talk” con la vía MAPK y procesos asociados a la autofagia.

p70 S6 kinase β El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RPS6KB2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

p70 S6 kinase β El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RPS6KB2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RPS6KB2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de p70 S6 kinase β. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RPS6KB2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de p70 S6 kinase β en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía p70 S6 kinase β en células tumorales con expresión de RPS6KB2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.