p47phox Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417916-ACT

NCF1 codifica a p47phox, uma subunidade organizadora citosólica do complexo NADPH oxidase de fagócitos (NOX2) que é essencial para a montagem e ativação, dependentes de estímulo, da produção de superóxido. Após a fosforilação, a p47phox transloca-se para as membranas e coordena interações entre p67phox, p40phox e o citocromo b558 ligado à membrana (gp91phox/NOX2 e p22phox), permitindo a geração de espécies reativas de oxigénio durante respostas imunitárias inatas. Esta explosão oxidativa sustenta a defesa antimicrobiana, a sinalização redox e a modulação de vias inflamatórias, ligando a atividade de NCF1 à função de neutrófilos e macrófagos. Alterações na função de NCF1/p47phox estão associadas a fenótipos de imunodeficiência, como a doença granulomatosa crónica, e têm sido estudadas no contexto de inflamação desregulada e autoimunidade.

p47phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NCF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p47phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NCF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NCF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p47phox. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NCF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p47phox no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p47phox em células tumorais com expressão de NCF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.