P2Y2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422096-ACT

Il gene murino **P2ry2** codifica il recettore purinergico **P2Y2** (P2Y2R), un recettore accoppiato a proteine G attivato da ATP e UTP extracellulari che si accoppia principalmente a **Gq/11** per stimolare la fosfolipasi C, la mobilizzazione di **Ca2+** intracellulare e la segnalazione dipendente da PKC. P2Y2 coinvolge anche le vie **MAPK/ERK** e **PI3K** e può modulare il rimodellamento del citoscheletro e la migrazione legata alle integrine, supportando ruoli nel trasporto epiteliale, nelle risposte meccanosensoriali e nel traffico leucocitario. Nei tessuti immunitari e di barriera, la segnalazione di P2Y2 contribuisce alla produzione di chemochine e a risposte di stress adiacenti all’inflammasoma guidate dai nucleotidi rilasciati durante il danno tissutale. La segnalazione purinergica disregolata che coinvolge P2Y2 è stata studiata nelle malattie infiammatorie del polmone, nel rimodellamento cronico delle vie aeree, nel dolore e nella neuroinfiammazione, e nella segnalazione microambientale associata ai tumori, rendendo **P2ry2** un bersaglio utile per l’interrogazione di vie e fenotipi in modelli murini.

P2Y2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2ry2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2Y2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2ry2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2ry2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2Y2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2ry2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2Y2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2Y2 nelle cellule tumorali con espressione di P2ry2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.