P2Y2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422096-ACT

Das murine Gen P2ry2 kodiert den purinergen Rezeptor P2Y2 (P2Y2R), einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der durch extrazelluläres ATP und UTP aktiviert wird und primär an Gq/11 koppelt, um die Phospholipase C zu stimulieren, intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung auszulösen und PKC‑abhängige Signalwege zu aktivieren. P2Y2 bindet zudem MAPK/ERK‑ und PI3K‑assoziierte Signalwege ein und kann den Umbau des Zytoskeletts sowie eine integrinverknüpfte Migration modulieren, was Rollen im epithelialen Transport, in mechanosensorischen Antworten und im Leukozyten‑Trafficking unterstützt. In Immun‑ und Barrieregeweben trägt die P2Y2‑Signalgebung zur Chemokinproduktion und zu inflammasom‑nahen Stressantworten bei, die durch bei Gewebeschädigung freigesetzte Nukleotide angetrieben werden. Dysregulierte purinerge Signalgebung unter Beteiligung von P2Y2 wurde bei entzündlichen Lungenerkrankungen, chronischem Atemwegs‑Remodeling, Schmerz und Neuroinflammation sowie in der tumorassoziierten Signalgebung des Mikromilieus untersucht, wodurch P2ry2 ein nützliches Ziel für die Untersuchung von Signalwegen und Phänotypen in Mausmodellen ist.

P2Y2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P2ry2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

P2Y2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P2ry2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P2ry2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen P2Y2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P2ry2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von P2Y2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des P2Y2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P2ry2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.