p21-ARC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403677-ACT

ARPC3 kodiert p21-ARC, eine essenzielle Untereinheit des Arp2/3-Komplexes, der verzweigte Aktinfilament-Netzwerke nukleiert und so die Bildung von Lamellipodien, Membranprotrusionen und die Kraftgenerierung während der Zellmigration antreibt. Durch die koordinierte Regulation durch GTPasen der Rho-Familie und Nukleations-aktivierende Faktoren wie die WAVE- und WASP-Familien unterstützt p21-ARC aktinabhängige Prozesse einschließlich Endozytose, Phagozytose, Vesikeltransport und Organisation der immunologischen Synapse. Störungen des Arp2/3-vermittelten Zytoskelett-Remodelings beeinflussen die epitheliale Morphogenese, das neurale Auswachsen und die Leukozytenmotilität und verknüpfen die ARPC3-Aktivität mit Mechanismen, die häufig in der Invasions- und Metastasierungsbiologie genutzt werden. Als zentraler Aktinregulator wird ARPC3 häufig in Signalwegen untersucht, die Zellform, den Turnover von Adhäsionen und Mechanotransduktion unter normalen sowie krankheitsrelevanten Bedingungen steuern.

p21-ARC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARPC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p21-ARC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARPC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARPC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p21-ARC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARPC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p21-ARC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p21-ARC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARPC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.