Plasmide CRISPR d'Activation (h) p19 INK4D/CDKN2D: sc-401761-ACT

CDKN2D code p19^INK4D, un membre de la famille INK4 des inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines, qui freine sélectivement l’activité de CDK4 et CDK6 afin d’imposer le point de contrôle G1/S. En limitant la phosphorylation des protéines RB et en modulant les programmes transcriptionnels pilotés par E2F, p19^INK4D contribue au contrôle de la prolifération, de la différenciation et de la sénescence cellulaire. CDKN2D s’inscrit dans des réseaux de régulation du cycle cellulaire et de réponse au stress, avec une pertinence fonctionnelle dans des contextes de signalisation oncogénique où l’intégrité de l’axe CDK4/6–RB conditionne le contrôle de la croissance. Des altérations de la régulation de CDKN2D ont été étudiées en cancérologie et dans d’autres états hyperprolifératifs afin de mieux comprendre le contournement des points de contrôle, l’engagement de lignée et la stabilité du génome.

p19 INK4D/CDKN2D Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDKN2D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p19 INK4D/CDKN2D Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDKN2D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDKN2D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p19 INK4D/CDKN2D. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDKN2D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p19 INK4D/CDKN2D au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p19 INK4D/CDKN2D dans les cellules tumorales présentant une expression de CDKN2D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.