OBFC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405050-ACT

STN1 kodiert OBFC1, eine zentrale Untereinheit des CST‑Komplexes (CTC1–STN1–TEN1), der an einzelsträngige DNA bindet und den Schutz der Telomerenden mit genomweiten Reaktionen auf Replikationsstress koordiniert. OBFC1 unterstützt die Auffüllsynthese des Telomer‑C‑Strangs und fördert einen korrekten Verlauf der Replikationsgabel, wodurch eine übermäßige Anreicherung einzelsträngiger DNA und abnorme DNA‑Schadenssignale verhindert werden. Über Interaktionen mit DNA‑Polymerase α/Primase und Crosstalk mit ATR‑abhängigen Checkpoint‑Signalwegen trägt OBFC1 zum Wiederanlaufen der Replikation und zur Aufrechterhaltung der Chromosomenstabilität bei. Eine Fehlregulation von CST‑Komponenten wurde mit Defekten der Telomerlänge, erhöhter Genominstabilität und einer Anfälligkeit für Erkrankungen in Verbindung gebracht, die durch beeinträchtigte DNA‑Replikation und Telomererhalt gekennzeichnet sind.

OBFC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OBFC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OBFC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OBFC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OBFC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.