Plásmido CRISPR de Activación (h) NPC2: sc-402010-ACT

El NPC2 humano codifica una proteína soluble lisosomal de unión al colesterol que coopera con NPC1 para movilizar colesterol no esterificado y otros lípidos desde los endosomas tardíos/lisosomas hacia rutas posteriores de tráfico intracelular. La actividad de NPC2 contribuye a la homeostasis de esteroles, la composición de membranas y la señalización dependiente de lípidos al regular la salida de colesterol y su distribución hacia el retículo endoplásmico y la membrana plasmática. La alteración del transporte dependiente de NPC2 provoca acumulación de lípidos en los lisosomas y perturba la función endolisosomal, lo que vincula a NPC2 con la enfermedad de Niemann-Pick tipo C2 y con vías más amplias implicadas en la neurodegeneración y la disfunción metabólica. Como componente central del tráfico intracelular de lípidos, NPC2 se estudia con frecuencia en mecanismos que regulan la dinámica autofagia-lisosoma, el transporte vesicular y los programas de expresión génica regulados por colesterol.

NPC2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NPC2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NPC2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NPC2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NPC2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NPC2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NPC2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NPC2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NPC2 en células tumorales con expresión de NPC2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.