NPAS2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405236-ACT

NPAS2 humano (proteína 2 do domínio PAS neuronal) é um fator de transcrição do tipo hélice–alça–hélice básica (bHLH) com domínio PAS que atua como um componente central do relógio circadiano molecular. A NPAS2 forma heterodímeros com ARNTL/BMAL1 para se ligar a elementos E-box e conduzir programas transcricionais rítmicos que regulam o timing do ciclo sono–vigília, o metabolismo, a sinalização hormonal e a excitabilidade neuronal. Por meio do controle transcricional de genes controlados pelo relógio, a NPAS2 integra sinais ambientais e celulares a vias como o ajuste/arrastamento circadiano e a homeostase energética. A desregulação de redes transcricionais associadas à NPAS2 tem sido ligada a alterações do comportamento circadiano e vem sendo estudada em contextos que incluem fenótipos neuropsiquiátricos, características metabólicas e a disrupção do relógio associada ao câncer.

NPAS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPAS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NPAS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPAS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPAS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NPAS2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPAS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NPAS2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NPAS2 em células tumorais com expressão de NPAS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.