NOS2/iNOS CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421928-ACT

Das murine Nos2 kodiert die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS2/iNOS), ein entzündungsresponsives Enzym, das die Produktion von Stickstoffmonoxid aus L-Arginin katalysiert und damit das Redoxgleichgewicht sowie die antimikrobielle Abwehr beeinflusst. iNOS wird auf transkriptioneller Ebene nachgeschaltet an Signale der angeborenen Immunität reguliert, darunter NF-κB- und interferongetriebene Signalwege, und trägt zur Polarisierung von Makrophagen und zu Zytokinnetzwerken bei. Eine anhaltende NOS2-Aktivität kann nitrosativen Stress, Protein-S-Nitrosylierung und DNA-Schäden fördern und verknüpft dadurch fehlregulierte Stickstoffmonoxid-Signalgebung mit entzündlicher Gewebeschädigung und veränderter Biologie des Tumormikromilieus. Nos2 wird häufig als funktioneller Readout für aktivierte myeloische Zellen genutzt und als mechanistischer Knotenpunkt, der Immunstimulation mit metabolischen sowie oxidativen Stressantworten verbindet.

NOS2/iNOS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Nos2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NOS2/iNOS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Nos2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Nos2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NOS2/iNOS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Nos2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NOS2/iNOS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NOS2/iNOS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Nos2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.