NKCC1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422971-ACT

Das murine Slc12a2 kodiert NKCC1 (SLC12A2), einen elektroneutralen Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Cotransporter, der die intrazelluläre Chlorid-Homöostase, die Kontrolle des Zellvolumens und die Flüssigkeitssekretion in Epithelien reguliert. Durch die Festlegung der zytosolischen Cl⁻-Spiegel beeinflusst NKCC1 die Membran-Erregbarkeit und die inhibitorische Neurotransmission über Wechselwirkungen mit der GABAergen Signalübertragung und umfassenderen Ionentransport-Netzwerken. Die NKCC1-Aktivität trägt zu osmotischen Stressantworten und zum transepithelialen Salztransport in sekretorischen Epithelien bei und ist damit mit physiologischen Prozessen im Nervensystem, in der Lunge und im Gastrointestinaltrakt verknüpft. Eine Fehlregulation des NKCC1-abhängigen Chloridtransports wurde in Modellen mit erhöhter neuronaler Erregbarkeit sowie mit entzündlichen Phänotypen der Atemwege und des Darms in Verbindung gebracht und stützt mechanistische Untersuchungen des Ionengleichgewichts in krankheitsrelevanten Kontexten.

NKCC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc12a2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NKCC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc12a2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc12a2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NKCC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc12a2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NKCC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NKCC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc12a2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.