NIK CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424749-ACT

Map3k14 kodiert die NF-κB-induzierende Kinase (NIK), eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Regulator des nicht-kanonischen NF-κB-Signalwegs fungiert. NIK integriert Signale ausgewählter Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie, fördert die Aktivierung von IKKα und die Prozessierung von p100 (NF-κB2) zu p52 und prägt damit Transkriptionsprogramme, die die lymphoide Entwicklung, das Überleben von B-Zellen und entzündliche Signalübertragung steuern. Eine strenge Kontrolle von Stabilität und Aktivität von NIK ist für die Immunhomöostase essenziell, und eine fehlregulierte NIK–NF-κB2-Signalgebung wurde in experimentellen Modellen mit aberranten Entzündungszuständen sowie mit Biologie in Verbindung gebracht, die mit lymphoiden Malignomen assoziiert ist. In Mausmodellen wird Map3k14 häufig genutzt, um das Zusammenspiel zwischen nicht-kanonischer NF-κB-Signalgebung, Zytokinnetzwerken und Zellschicksalsentscheidungen in Immun- und Stromakompartimenten zu untersuchen.

NIK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Map3k14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NIK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Map3k14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Map3k14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NIK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Map3k14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NIK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NIK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Map3k14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.