NHE-9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410416-ACT

SLC9A9 kodiert den endosomalen Na+/H+-Austauscher NHE-9, ein Multi-Pass-Membranprotein, das den luminalen pH-Wert und die Natriumhomöostase in Recycling- und Sortierungsendosomen reguliert. Durch die Feinabstimmung der endosomalen Ansäuerung beeinflusst NHE-9 das Rezeptor-Trafficking, die Dissoziation von Ligand und Rezeptor sowie das Gleichgewicht zwischen Recycling und lysosomalem Abbau und prägt damit Signalausgänge und die Zusammensetzung von Membranproteinen. Diese Funktion verknüpft SLC9A9 mit Netzwerken des vesikulären Transports und pH-abhängigen Prozessen, die synaptische Aktivität, die Regulation von Nährstofftransportern und zelluläre Stressantworten beeinflussen. Eine veränderte SLC9A9-Expression oder gestörte Kontrolle des endosomalen pH-Werts wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und weiteren Zuständen in Verbindung gebracht, die mit dysfunktionalem Trafficking und gestörter Signalübertragung zusammenhängen.

NHE-9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC9A9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NHE-9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC9A9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC9A9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NHE-9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC9A9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NHE-9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NHE-9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC9A9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.