Neprilysin-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405449-ACT

MMEL1 kodiert Neprilysin-2 (membrane metalloendopeptidase-like 1), eine zinkabhängige Metalloprotease, die an der Zelloberfläche sowie in endomembranösen Kompartimenten exprimiert wird und zur Prozessierung und zum Umsatz von Peptiden beiträgt. Durch die regulierte Proteolyse bioaktiver Peptide kann Neprilysin-2 die lokale Signaldynamik, die Zusammensetzung des extrazellulären Mikromilieus und die rezeptorvermittelte Kommunikation beeinflussen und verknüpft die MMEL1-Aktivität damit mit der Proteostase und inflammatorischen Signalnetzwerken. Genetische Assoziationsstudien haben den MMEL1-Lokus mit immunvermittelten Merkmalen und der Neuroinflammationsbiologie in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für Signalwege stützt, die den Peptidstoffwechsel mit der Immunregulation koppeln. Diese Eigenschaften machen MMEL1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur proteaseabhängigen Signalübertragung, Zell-Zell-Kommunikation und krankheitsrelevanten regulatorischen Schaltkreisen.

Neprilysin-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MMEL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Neprilysin-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MMEL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MMEL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Neprilysin-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MMEL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Neprilysin-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Neprilysin-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MMEL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.