nephrocystin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404375-ACT

NPHP1 kodiert Nephrocystin, ein zilienassoziiertes Adapterprotein, das in die primäre Zilie sowie in zentrosomale/Basalkörper-Kompartimente lokalisiert, wo es den Aufbau der Zilie, den intraziliären Transport und die Signalübertragung unterstützt. Nephrocystin koordiniert Multiprotein-Komplexe, die an epithelialer Zellpolarität, Mechanosensation und der Organisation des Zytoskeletts beteiligt sind, und verknüpft damit die Zilienstruktur mit nachgeschalteten Signalwegen, die Differenzierung und Gewebehomöostase regulieren. Eine gestörte NPHP1-Funktion ist eng mit nephronophthiseassoziierten Ziliopathien und syndromalen Phänotypen verbunden, die aus beeinträchtigter Ziliensignalgebung und gestörter epithelialer Integrität resultieren. Daher wird NPHP1 häufig in Modellen der renalen Tubulogenese, der Dynamik des ziliären Transports und der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in der Ziliopathie-Forschung untersucht.

nephrocystin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPHP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

nephrocystin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPHP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPHP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen nephrocystin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPHP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von nephrocystin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des nephrocystin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPHP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.