Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nek9: sc-404971-ACT

NEK9 code la kinase sérine/thréonine Nek9, un régulateur central de la fonction du centrosome et de la progression mitotique. Nek9 coordonne l’assemblage du fuseau et la dynamique des microtubules en activant des kinases en aval apparentées à NIMA et en intégrant des événements de phosphorylation qui contrôlent la séparation des centrosomes, l’entrée en mitose et la cytocinèse. Du fait de ses rôles dans le contrôle du cycle cellulaire et la stabilité du génome, une activité altérée de NEK9 est pertinente pour l’étude de l’instabilité chromosomique et des phénotypes liés à la prolifération observés en cancérologie et dans certains troubles du développement. NEK9 interfère également avec des voies de signalisation sensibles au stress susceptibles d’influencer la fidélité des points de contrôle et la sortie de mitose.

Nek9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NEK9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nek9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NEK9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NEK9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nek9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NEK9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nek9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nek9 dans les cellules tumorales présentant une expression de NEK9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.