Ndfip1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403470-ACT

NDFIP1 (Ndfip1) kodiert ein endosomales Adapterprotein, das mit HECT-E3-Ubiquitin-Ligasen der NEDD4-Familie interagiert und dazu beiträgt, Membranproteine mit Ubiquitinierung, Transport (Trafficking) und Abbau zu koppeln. Durch die Regulation der ubiquitinabhängigen Sortierung trägt Ndfip1 zur Kontrolle der Intensität von Rezeptorsignalen, der Endosomendynamik und von Proteostase-Wegen bei, die immunologische und stressresponsive zelluläre Zustände prägen. Eine veränderte NDFIP1-Aktivität wurde mit fehlregulierter inflammatorischer Signalgebung und gestörter Immunhomöostase in Verbindung gebracht und ist damit relevant für mechanistische Studien zur Signalanpassung und zur Kontrolle ubiquitinvermittelter Signalwege. In humanen Zellmodellen wird die Modulation der NDFIP1-Expression eingesetzt, um zu untersuchen, wie E3-Ligase-Targeting nachgeschaltete Transkriptionsprogramme und zelluläre Phänotypen beeinflusst, die mit der Immunregulation verknüpft sind.

Ndfip1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NDFIP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ndfip1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NDFIP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NDFIP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ndfip1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NDFIP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ndfip1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ndfip1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NDFIP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.