Plasmide CRISPR d'Activation (h) NBR1: sc-402592-ACT

NBR1 humain (neighbor of BRCA1 gene 1) code un récepteur d’autophagie sélective qui reconnaît les cargos ubiquitinylés et les relie à des autophagosomes positifs pour LC3 via des interactions dépendantes du motif LIR. NBR1 coopère avec SQSTM1/p62 dans l’aggréphagie, la mitophagie et le contrôle de la protéostase, en favorisant l’élimination des agrégats protéiques et des organites endommagés lors d’un stress cellulaire. Par ces fonctions, NBR1 contribue à la régulation de la signalisation de l’immunité innée, des réponses au stress oxydant et du contrôle qualité dépendant des lysosomes. Une autophagie associée à NBR1 dérégulée a été impliquée dans des voies pertinentes pour la neurodégénérescence, la biologie des cancers et des phénotypes inflammatoires, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques du flux autophagique et de la signalisation de l’ubiquitine.

NBR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NBR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NBR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NBR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NBR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NBR1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NBR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NBR1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NBR1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NBR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.