Plasmide CRISPR d'Activation (h) Myosin Vb: sc-403324-ACT

MYO5B code pour la protéine motrice à base d’actine myosine Vb, un régulateur clé du trafic membranaire intracellulaire qui coordonne la dynamique des endosomes de recyclage et le transport polarisé. La myosine Vb interagit avec des GTPases Rab pour orienter le déplacement des vésicules et la livraison des cargos, soutenant la polarité apico-basolatérale, le maintien des jonctions serrées et le recyclage des récepteurs dans les cellules épithéliales. La perturbation du trafic dépendant de MYO5B dérègle l’organisation de la bordure en brosse et la localisation des protéines membranaires, des processus centraux pour l’homéostasie de l’épithélium intestinal. Le dysfonctionnement de MYO5B est fortement associé à des entéropathies congénitales telles que la maladie des inclusions microvillositaires et des phénotypes cholestatiques apparentés, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la polarité épithéliale et du tri endosomal.

Myosin Vb Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MYO5B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Myosin Vb Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MYO5B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MYO5B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Myosin Vb. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MYO5B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Myosin Vb au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Myosin Vb dans les cellules tumorales présentant une expression de MYO5B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.