Plásmido CRISPR de Activación (m) mtTFA: sc-423355-ACT

Tfam codifica el factor de transcripción mitocondrial A (mtTFA), una proteína del grupo de alta movilidad (HMG) que se une al ADN mitocondrial para empaquetar los nucleoides y regular la transcripción y la replicación del genoma mitocondrial. mtTFA es un determinante central del número de copias de ADNmt y de la expresión génica mitocondrial, influyendo así en la fosforilación oxidativa, la producción de ATP y la homeostasis de las especies reactivas de oxígeno. A través de estas funciones, se integra con los programas de biogénesis mitocondrial y las vías de comunicación núcleo–mitocondria que moldean el metabolismo celular y las respuestas al estrés. La actividad alterada de TFAM y el mantenimiento del ADNmt se investigan con frecuencia en modelos de disfunción neuromuscular, neurodegeneración, fenotipos cardiometabólicos e inflamación impulsada por señales de estrés mitocondrial.

mtTFA El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Tfam sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

mtTFA El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Tfam en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Tfam, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de mtTFA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Tfam y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de mtTFA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía mtTFA en células tumorales con expresión de Tfam silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.