MtRPOL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403497-ACT

Das humane Gen **POLRMT** kodiert die mitochondriale RNA-Polymerase (MtRPOL), ein nukleär kodiertes Enzym, das für die Transkription des mitochondrialen Genoms verantwortlich ist und dabei rRNAs, tRNAs und mRNAs erzeugt, die für die oxidative Phosphorylierung benötigt werden. MtRPOL wirkt innerhalb des mitochondrialen Transkriptionsapparats zusammen mit TFAM und TFB2M und ist eng mit der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA, der Ribosomenbiogenese und dem Zusammenbau der Atmungskette gekoppelt. Durch die Steuerung der mitochondrialen Genexpression unterstützt POLRMT die ATP-Produktion, die Redox-Homöostase und Stressantworten, die mit Signalwegen der mitochondrialen Qualitätskontrolle verknüpft sind. Eine Dysregulation der mitochondrialen Transkription und der POLRMT-Aktivität ist mit beeinträchtigter Bioenergetik assoziiert und ist relevant für die Erforschung mitochondrialer Erkrankungen sowie neurodegenerationsassoziierter mitochondrialer Dysfunktionen.

MtRPOL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLRMT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MtRPOL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLRMT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLRMT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MtRPOL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLRMT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MtRPOL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MtRPOL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLRMT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.