Plasmide CRISPR d'Activation (h) MTHFD1: sc-403353-ACT

Le gène humain **MTHFD1** code une enzyme cytosolique trifonctionnelle dépendante des folates, qui catalyse l’interconversion des tétrahydrofolates **10-formyl-**, **5,10-méthényl-** et **5,10-méthylène-**, fournissant ainsi les unités monocarbonées nécessaires à la biosynthèse *de novo* des purines et du thymidylate, ainsi qu’aux réactions de méthylation. En couplant le métabolisme des folates à la production de nucléotides, **MTHFD1** soutient la réplication et la réparation de l’ADN, ainsi que la progression du cycle cellulaire, en particulier lorsque la demande proliférative est élevée. Un dérèglement du métabolisme à un carbone a été associé à l’instabilité génomique et à des états épigénétiques altérés, faisant de **MTHFD1** une cible fréquemment étudiée dans le contexte du remodelage métabolique et de l’adaptation au stress. Des variations génétiques ou une expression perturbée de **MTHFD1** sont également associées à des phénotypes liés aux folates et à une susceptibilité accrue à des troubles impliquant un déséquilibre des nucléotides et une disponibilité réduite des donneurs de méthyle.

MTHFD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTHFD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MTHFD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTHFD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTHFD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MTHFD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTHFD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MTHFD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MTHFD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MTHFD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.