MetRS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402763-ACT

Das humane MARS kodiert die Methionyl‑tRNA‑Synthetase (MetRS), eine Aminoacyl‑tRNA‑Synthetase der Klasse I, die Methionin an Initiator‑ und Elongator‑tRNA^Met koppelt und damit die Translationsinitiation etabliert sowie die globale Proteinsynthese aufrechterhält. Die MetRS‑Aktivität verknüpft die Verfügbarkeit von Aminosäuren mit der ribosomalen Output‑Leistung und der Proteostase und beeinflusst Stressantworten wie die integrierte Stressantwort sowie mTOR‑gekoppelte Nährstoffsignalwege, indem sie die Translationskapazität bestimmt. Als zentraler Bestandteil der zytosolischen Translationsmaschinerie können veränderte MARS‑Expression oder -Funktion zelluläre Wachstumsprogramme, die mitochondriale und ER‑Homöostase über ein Proteom‑Ungleichgewicht sowie adaptive Antworten auf Aminosäurelimitierung stören. Eine Fehlregulation translationsbezogener Faktoren, einschließlich Aminoacyl‑tRNA‑Synthetasen, wird häufig im Zusammenhang mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen, der Fitness von Krebszellen und inflammatorischer Signalgebung untersucht, bei denen die Translationskontrolle den Zellzustand prägt.

MetRS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MARS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MetRS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MARS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MARS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MetRS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MARS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MetRS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MetRS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MARS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.