Plásmido CRISPR de Activación (m) melanopsin: sc-424378-ACT

El gen Opn4 de ratón codifica la melanopsina, una opsina retinal expresada principalmente en células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles, que media la fotorrecepción no relacionada con la formación de imágenes. La señalización de la melanopsina activa cascadas de fototransducción acopladas a proteínas G que elevan el calcio intracelular y modulan la excitabilidad de la membrana, vinculando la detección de luz con el fotoentrenamiento circadiano, el reflejo pupilar a la luz y la regulación del ciclo sueño–vigilia. A través de vías retina-cerebro que involucran al núcleo supraquiasmático y otras dianas hipotalámicas, Opn4 influye en los ritmos neuroendocrinos y en la conducta dependiente de la luz. La desregulación de circuitos dependientes de la melanopsina se ha asociado con alteraciones en la temporización circadiana, respuestas pupilares modificadas y fenotipos de sensibilidad a la luz relevantes para la investigación neuroconductual y retinal.

melanopsin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Opn4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

melanopsin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Opn4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Opn4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de melanopsin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Opn4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de melanopsin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía melanopsin en células tumorales con expresión de Opn4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.