melanopsin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402783-ACT

L’OPN4 umano codifica la melanopsina, un’opsina retinica e fotopigmento accoppiato a proteine G, noto soprattutto per mediare la fotosensibilità intrinseca in cellule gangliari retiniche specializzate. In seguito all’attivazione da parte della luce, la melanopsina si accoppia principalmente alla segnalazione Gq/11 per stimolare PLCβ, aumentare il calcio intracellulare e modulare vie a valle che influenzano l’eccitabilità neuronale e programmi trascrizionali. Questo asse di fototrasduzione contribuisce a funzioni visive non legate alla formazione dell’immagine, tra cui il foto-entrainment circadiano e la regolazione del riflesso pupillare alla luce, collegando l’attività di OPN4 alla tempistica sonno–veglia e ai ritmi neuroendocrini. Alterazioni della segnalazione della melanopsina sono state studiate nel contesto della disregolazione circadiana e di risposte fisiologiche dipendenti dalla luce, rilevanti per la ricerca neurocomportamentale e retinica.

melanopsin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPN4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

melanopsin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPN4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPN4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di melanopsin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPN4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da melanopsin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via melanopsin nelle cellule tumorali con espressione di OPN4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.