Plásmido CRISPR de Activación (h) MEL-1A-R: sc-401075-ACT

MTNR1A codifica el receptor de melatonina 1A (MEL-1A-R), un GPCR acoplado a Gi/o que media las respuestas celulares a la melatonina tanto en tejidos centrales como periféricos. La activación del receptor suele suprimir la actividad de la adenilato ciclasa, modular la señalización de AMPc/PKA y puede influir en vías vinculadas a MAPK/ERK y PI3K, configurando programas transcripcionales que coordinan el tiempo circadiano y la regulación neuroendocrina. La señalización de MTNR1A contribuye al control de los ritmos sueño-vigilia, la función del eje reproductor y la homeostasis metabólica, y las alteraciones en la expresión o en la señalización del receptor se asocian a fenotipos de desalineación circadiana y a contextos de investigación sobre enfermedades neuropsiquiátricas y metabólicas relacionadas. Como receptor de membrana con salidas de señalización dependientes de ligando bien definidas, MTNR1A se utiliza con frecuencia para estudiar el acoplamiento de vías de los GPCR, la desensibilización/internalización del receptor y redes génicas controladas por el reloj.

MEL-1A-R El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MTNR1A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MEL-1A-R El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MTNR1A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MTNR1A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MEL-1A-R. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MTNR1A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MEL-1A-R en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MEL-1A-R en células tumorales con expresión de MTNR1A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.