MEK-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401459-ACT

Das humane MAP2K4-Gen kodiert MEK-4 (MKK4), eine dualspezifische MAP-Kinase-Kinase, die Stress- und Zytokinsignale an die nachgeschalteten JNK- und p38-MAPK-Signalwege weiterleitet. Durch die Phosphorylierung von MAPKs wie MAPK8/9 (JNK) und MAPK14 (p38) reguliert MEK-4 Transkriptionsprogramme, die Apoptose, Entzündung, Differenzierung und Zellmotilität steuern. Die MAP2K4-abhängige Signalübertragung überschneidet sich mit TGF-β-, TNF- und angeborenen Immunwegen und prägt dadurch zelluläre Antworten auf Stress im Mikromilieu. Eine Fehlregulation oder genetische Veränderung von MAP2K4 wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, darunter krebsassoziierte Signalveränderungen und entzündliche Pathobiologie, was MAP2K4 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien des MAPK-Netzwerkverhaltens macht.

MEK-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAP2K4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MEK-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAP2K4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAP2K4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MEK-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAP2K4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MEK-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MEK-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAP2K4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.