Plásmido CRISPR de Activación (h) MCM4: sc-402451-ACT

El MCM4 humano codifica una subunidad central del complejo helicasa MCM2–7, que licencia los orígenes de replicación y promueve el desenrollamiento de la doble hélice de ADN durante la fase S. Al coordinar la activación de orígenes, la progresión de las horquillas de replicación y las respuestas de los puntos de control de replicación, MCM4 contribuye a la estabilidad del genoma dentro de las vías de replicación del ADN y de respuesta al daño del ADN. La alteración de la actividad de MCM4 puede favorecer el estrés replicativo, el colapso de las horquillas y la acumulación de lesiones en el ADN, procesos vinculados a la inestabilidad cromosómica observada en la biología del cáncer y en otros trastornos proliferativos. En consecuencia, MCM4 se utiliza ampliamente como un nodo mecanístico para estudiar el control del ciclo celular, la señalización del estrés replicativo y la interconexión entre vías de reparación del ADN.

MCM4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MCM4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MCM4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MCM4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MCM4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MCM4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MCM4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MCM4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MCM4 en células tumorales con expresión de MCM4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.