MCM4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402451-ACT

O MCM4 humano codifica uma subunidade central do complexo helicase MCM2–7, que licencia as origens de replicação e impulsiona o desenrolamento da dupla hélice de DNA durante a fase S. Ao coordenar a ativação das origens, a progressão das forquilhas de replicação e as respostas dos checkpoints de replicação, o MCM4 sustenta a estabilidade do genoma no âmbito das vias de replicação do DNA e de resposta a danos no DNA. A perturbação da atividade do MCM4 pode promover estresse de replicação, colapso das forquilhas e acúmulo de lesões no DNA, processos associados à instabilidade cromossômica observada na biologia do câncer e em outros distúrbios proliferativos. Assim, o MCM4 é amplamente utilizado como um nó mecanístico para estudar o controle do ciclo celular, a sinalização de estresse de replicação e a comunicação cruzada entre vias de reparo do DNA.

MCM4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MCM4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MCM4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MCM4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MCM4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MCM4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MCM4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MCM4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MCM4 em células tumorais com expressão de MCM4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.