MBD3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401072-ACT

Humanes MBD3 kodiert das Methyl-CpG-Bindedomänen-Protein 3, einen zentralen Bestandteil des NuRD‑Komplexes (Nukleosomen‑Remodeling und Deacetylase), der ATP‑abhängiges Chromatin‑Remodeling mit Histon‑Deacetylierung verknüpft, um Transkriptionsprogramme zu regulieren. MBD3 trägt zur epigenetischen Kontrolle der Zellidentität bei, einschließlich Differenzierung und Übergängen der Pluripotenz, indem es Genrepression bzw. ein „Poising“ an Promotoren und Enhancern koordiniert und die Chromatinzugänglichkeit beeinflusst. Über seine Rolle in der Chromatinorganisation ist MBD3 mit Signalwegen verknüpft, die DNA‑Schadensantworten, Replikations‑Timing und Entwicklungs‑Genetzwerke steuern. Eine fehlregulierte NuRD/MBD3‑Aktivität wurde mit aberranten Transkriptionszuständen bei Krebs sowie mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was MBD3 für Studien zu epigenetischen Mechanismen krankheitsassoziierter Veränderungen der Genexpression relevant macht.

MBD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MBD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MBD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MBD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MBD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MBD3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MBD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MBD3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MBD3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MBD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.