Plasmide CRISPR d'Activation (h) MARCH5: sc-404655-ACT

MARCH5 (également connu sous le nom de MITOL) code une ligase E3 de type RING de l’ubiquitine, localisée sur la membrane externe mitochondriale, qui régule l’ubiquitination et le renouvellement des protéines afin de maintenir l’homéostasie mitochondriale. En coordonnant la dynamique mitochondriale, le contrôle qualité et la signalisation, MARCH5 influence l’équilibre fission–fusion et participe à des voies sensibles au stress qui croisent la mitophagie et l’apoptose. Il module la stabilité de protéines mitochondriales clés impliquées dans la morphologie de l’organite et la protéostasie, façonnant ainsi les réponses cellulaires au stress oxydant et au stress protéotoxique. Une activité dérégulée de MARCH5 a été associée à une altération de la fonction mitochondriale observée en oncologie et à des phénotypes cellulaires liés à la neurodégénérescence, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques des réseaux de signalisation mitochondriale.

MARCH5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MARCH5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MARCH5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MARCH5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MARCH5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MARCH5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MARCH5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MARCH5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MARCH5 dans les cellules tumorales présentant une expression de MARCH5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.