Lyst CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410730-ACT

Humanes **LYST** (lysosomaler Trafficking‑Regulator) kodiert **Lyst**, ein großes zytosolisches Protein, das die Größe, Positionierung und Membrandynamik lysosomenverwandter Organellen steuert, die für die Fusion von späten Endosomen mit Lysosomen und den Cargo‑Transport erforderlich sind. Durch die Regulierung von Vesikel‑Abschnürungs‑ und Fusionsereignissen beeinflusst Lyst die lysosomale Abbauleistung, die Antigenverarbeitung sowie die Sekretion aus spezialisierten Granula in Immun‑ und Pigmentzellen. Eine fehlregulierte LYST‑Aktivität wird mit Defekten der lysosomalen Homöostase und der Bildung abnormaler Riesengranula in Verbindung gebracht, die die Funktion angeborener und adaptiver Immunzellen beeinträchtigen, was LYST für Studien zu Immundefizienz und Pigmentierungsbiologie relevant macht. LYST wird daher häufig in Signalwegen untersucht, die den intrazellulären Transport, die Wechselwirkung zwischen Autophagie und Lysosomen sowie Stressantworten auf einen gestörten Organellenumsatz steuern.

Lyst Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LYST-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Lyst Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LYST-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LYST-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Lyst-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LYST-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Lyst-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Lyst-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LYST-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.