Plásmido CRISPR de Activación (h) LYPD8: sc-418674-ACT

LYPD8 (Ly6/PLAUR domain containing 8) codifica una proteína secretada de la familia Ly6, asociada a glicosilfosfatidilinositol (GPI), enriquecida en superficies mucosas, donde contribuye a la homeostasis de la barrera epitelial y a las interacciones huésped–microbio. En el tracto gastrointestinal, se ha implicado a LYPD8 en la limitación del acceso bacteriano a la capa epitelial mediante la modulación de la motilidad microbiana y de la organización espacial dentro del moco, configurando así el tono de la inmunidad innata. A través de estos procesos asociados a la barrera, LYPD8 se cruza con vías que regulan la defensa mucosa, la inflamación y la señalización dependiente del microbioma. La expresión o función alteradas de LYPD8 se han asociado con estados inflamatorios intestinales y respuestas de estrés epitelial, lo que respalda su relevancia en modelos de colitis, disbiosis y disfunción de la barrera.

LYPD8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de LYPD8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LYPD8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus LYPD8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional LYPD8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LYPD8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo LYPD8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LYPD8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LYPD8 en células tumorales con expresión de LYPD8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.