Plásmido CRISPR de Activación (h) Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB: sc-402326-ACT

ARHGDIB codifica Ly-GDI (RhoGDI2), un inhibidor de la disociación de GDP de Rho enriquecido en células hematopoyéticas que se une a GTPasas preniladas de la familia Rho y controla su ciclo de asociación a membrana y su estado de activación. Al modular la señalización de RAC1, RHOA y CDC42, ARHGDIB regula la dinámica del citoesqueleto de actina, la adhesión celular, la quimiotaxis y las respuestas funcionales de los fagocitos, elementos centrales de la señalización inmunitaria innata. Esta vía se interconecta con redes de motilidad mediada por integrinas y de señalización inflamatoria que coordinan el tráfico de leucocitos y la vigilancia tisular. La expresión desregulada de ARHGDIB se ha vinculado con una migración alterada de células inmunitarias y fenotipos inflamatorios, y se estudia con frecuencia en el contexto de la biología de neoplasias hematológicas y de las interacciones con el microambiente tumoral.

Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ARHGDIB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ARHGDIB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ARHGDIB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ARHGDIB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB en células tumorales con expresión de ARHGDIB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.