Plasmide CRISPR d'Activation (m) Lsh: sc-420828-ACT

Mouse Hells code pour l’hélicase spécifique des tissus lymphoïdes (Lsh), un remodelleur de la chromatine de la famille SNF2 dépendant de l’ATP, qui régule le positionnement des nucléosomes, l’organisation de la chromatine à plus haut niveau, ainsi que les profils de méthylation de l’ADN à l’échelle du génome. Lsh contribue au maintien du silencement épigénétique des éléments répétitifs et influence les programmes transcriptionnels au cours du développement, de la différenciation et de la progression du cycle cellulaire en contrôlant l’accessibilité de la chromatine. Elle est fonctionnellement liée aux voies impliquées dans la formation de l’hétérochromatine, l’assemblage de la chromatine couplé à la réplication et la répression des éléments transposables, contribuant ainsi à la stabilité du génome. Une dérégulation du remodelage épigénétique associé à HELLS/Lsh a été impliquée dans des paysages de méthylation aberrants et des phénotypes d’instabilité chromosomique pertinents pour la biologie du cancer et la recherche en neurodéveloppement.

Lsh Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hells sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Lsh Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hells dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hells, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Lsh. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hells natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Lsh au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Lsh dans les cellules tumorales présentant une expression de Hells silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.