LRRC59 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404821-ACT

LRRC59 (leucine rich repeat containing 59) kodiert ein mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und der Kernhülle assoziiertes Membranprotein, das an der Proteintargetierung sowie am membranassoziierten Transport an der zytoplasmatischen Seite des ER beteiligt ist. LRRC59 wurde mit der Rekrutierung von Ribosomen und ko-translationalen Prozessen in Verbindung gebracht, die die Biogenese sekretorischer und membranständiger Proteine unterstützen, und steht damit in Zusammenhang mit ER-Homöostase- und Proteostase-Netzwerken. Aufgrund seiner Lokalisation an der Schnittstelle zwischen ER und Kernhülle wird LRRC59 zudem im Kontext der nukleo-zytoplasmatischen Organisation und des stressabhängigen Umbaus des Endomembransystems untersucht. Eine gestörte ER-Proteostase und veränderte Transportprogramme sind wiederkehrende Merkmale in der Krebs- und Neurodegenerationsforschung, wodurch LRRC59 ein nützlicher Knotenpunkt ist, um Veränderungen dieser krankheitsrelevanten Prozesse auf Signalweg-Ebene zu analysieren.

LRRC59 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LRRC59-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LRRC59 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LRRC59-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LRRC59-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LRRC59-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LRRC59-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LRRC59-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LRRC59-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LRRC59-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.